GS試劑在病理自動化染色中的應(yīng)用

GS試劑在病理自動化染色中的應(yīng)用

 

孫廷誼   謝紅建   孔令非  河南省人民醫(yī)院病理科

 

病理技術(shù)是病理診斷的基礎(chǔ)，常規(guī)病理是病理技術(shù)***重要的部分，它包括固定、脫水、切片、染色等幾個主要步驟，常用的固定劑為4%甲醛（10%福爾馬林），脫水透明的主要試劑為酒精和二甲苯。甲醛和二甲苯具有強烈的刺激性和揮發(fā)性，不僅污染環(huán)境，而且嚴(yán)重危害身體健康。因此，尋找一種對人體******無害且安全的甲醛和二甲苯替代品，已成為病理技術(shù)工作者的一種迫切愿望。本文將GS試劑制備的切片應(yīng)用于病理自動化染色，取得了滿意效果。

1  材料與方法

    1.1 材料  隨機選擇河南省人民醫(yī)院手術(shù)室送檢的新鮮標(biāo)本49例，包括乳腺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、宮頸癌、間質(zhì)瘤、淋巴瘤、扁桃體各7例。

    1.1.1 取材  取材時先取好一塊較大組織，然后把這一塊較大組織從中間橫切縱切各一刀分成4塊（每個組織塊不小于10 mm X 10 mm X 3 mm），以共同的的刀切面向下裝入組織脫水盒，固定時間24小時。

    1.1.2 實驗對照  49例標(biāo)本共取196塊，同一標(biāo)本的4塊組織分成A、B、C、D共4個組（每組49塊）：

    ①A組：用10%中******爾馬林固定、傳統(tǒng)方法脫水透明包埋。②B組：用GS無醛固定液固定、傳統(tǒng)方法脫水透明包埋。③C組：用10%中******爾馬林固定、GS系列脫水透明套液脫水透明包埋。④D組：用GS無醛固定液固定、GS系列脫水透明套液脫水透明包埋。

    1.1.3包埋  常規(guī)包埋蠟塊時，以共同的刀切面向下裝入組織包埋盒以便切片時組織結(jié)構(gòu)相近。

    1.1.4主要儀器和試劑  脫水機（Leica ASP 300型），Leica染-封一體機，Leica-Band全自動免疫組化染色儀。GS系列試劑（哈爾濱格林標(biāo)本技術(shù)開發(fā)有限公司）。免疫組化試劑一抗均為工作液（福州邁新生物技術(shù)公司），Leica機用染色試劑盒，HER-2基因擴增檢測試劑盒購自北京金菩嘉醫(yī)療科技有限公司。

1.2方法

    1.2.1 HE染色  將4個組蠟塊統(tǒng)一切片（厚3μm）后常規(guī)烤片，將GS染色系列套裝試劑放入Leica染-封一體機同時進(jìn)行全自動HE染色。

    1.2.2 IHC染色  為了使IHC染色具有可比性，必須盡量減少外在因素的干擾，便于染色后對切片進(jìn)行觀察分析，所以同種病例的每一標(biāo)本的A、B、C、D 4個組要各取一個相對應(yīng)的蠟塊放在一批統(tǒng)一進(jìn)行切片，厚3μm，65℃烤片15min，同種抗體每批染色共28張，選用相同的染色條件，在同一臺Leica-Band全自動免疫組化染色機上染色。乳腺癌組織檢測ER、 PR、C-erb-B2；結(jié)腸癌組織檢測CA19-9、 p53；卵巢癌組織檢測CA125、CD34；宮頸癌組織檢測P16、Ki67；間質(zhì)瘤組織檢測CD117、DOG-1；淋巴瘤組織檢測CD3、CD20；扁桃體組織檢測Bcl-2、Pax-5。

    1.2.3 FISH檢測  選擇7例乳腺癌中2例C-erb-B2+++陽性的標(biāo)本做FISH檢測。操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。結(jié)果判斷：浸潤性乳腺癌細(xì)胞核內(nèi)橘紅色HER-2基因熒光信號與17號染色體綠色熒光信號比值＞2.2時為HER-2基因擴增，＜1.8為無擴增，若比值在1.8～2.2之間，則需要再計數(shù)30個細(xì)胞核中的信號。

2 結(jié)果

    2.1 HE染色  A、B、C、D 4個組常規(guī)HE染色效果良好，細(xì)胞形態(tài)完整，核漿對比清晰。其中A、B、C 3個組切片的染色效果相當(dāng)，D組在切片中感覺組織塊軟硬適中，切片厚薄均勻，連續(xù)性較好，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)染色對比較鮮明、結(jié)構(gòu)較清晰。

    2.2 IHC染色結(jié)果  A、B、C、D 4個組免疫組化染色結(jié)果未見明顯差異，標(biāo)本組織的細(xì)胞抗原性保存好，陽性結(jié)果定位準(zhǔn)確，背景清晰，也未發(fā)現(xiàn)ER和PR有著色弱的現(xiàn)象。

    2.3 FISH檢測結(jié)果  2例乳腺癌C-erb-B2+++陽性的標(biāo)本做FISH檢測，結(jié)果均見有呈簇狀分布的紅色信號，檢測結(jié)果顯示細(xì)胞核結(jié)構(gòu)比較完整，紅色和綠色熒光信號較好，對比清晰。

3討論

甲醛具有較強烈的刺激性和腐蝕性，為致癌物質(zhì)，可造成空氣和環(huán)境污染而防護(hù)又極為困難。甲醛廢液需特殊處理，不能直接排入管道。用甲醛處理標(biāo)本，可引起組織內(nèi)廣泛的蛋白質(zhì)交聯(lián)，因而免疫組化染色時需進(jìn)行抗原修復(fù)。甲醛存放過久易產(chǎn)生白色沉淀即三聚甲醛，而影響組織標(biāo)本固定效果。甲醛不能固定肝糖原和尿酸，易氧化變成甲酸導(dǎo)致標(biāo)本酸化，影響細(xì)胞核的染色效果。使用甲醛固定的陳舊組織也可形成甲醛色素，使病理診斷受到嚴(yán)重影響。

GS試劑不含甲醛、二甲苯等有毒有害物質(zhì)，運用界面化學(xué)及電荷占位原理，對組織標(biāo)本進(jìn)行脫水、透明和浸蠟。GS試劑有較強的固定、脫水、脫脂兼硬化作用，不易導(dǎo)致組織過度收縮，無細(xì)胞空泡與核固縮現(xiàn)象產(chǎn)生，處理的組織軟硬適中，尤其對脂肪、淋巴組織等組織的處理效果較好，處理較堅韌的子宮肌瘤、皮膚組織也能使其具有較好的柔韌度而有利于切片。GS試劑對組織滲透性強，能縮短脫水時間，能保持良好的組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)，同時能保護(hù)細(xì)胞膜的完整性，能******限度地保護(hù)組織中的抗原和核酸不被破壞、降解或擴散，對DNA和RNA保存較佳，也有利于顯示細(xì)胞的亞結(jié)構(gòu)。GS固定液回收簡便易行，不需甲醛中和劑進(jìn)行處理廢液，可依據(jù)乙醇廢液處理管理條例處置廢液^[1]。   

經(jīng)過對中性甲醛固定、傳統(tǒng)方法脫水透明、GS無醛固定液固定、GS系列脫水透明套液脫水透明等幾種方法處理組織制片后的HE染色、IHC染色和FISH檢測綜合比較分析，我們體會到用GS無醛固定液固定、GS系列脫水透明套液試劑制作的D組切片所做的HE染色和全自動免疫組化染色和FISH檢測均能取得滿意的結(jié)果，能完全滿足臨床病理診斷的需要，可以替代甲醛和二甲苯毒害試劑的使用，降低室內(nèi)有毒有害氣體的污染和毒害，從而杜絕排放此類毒化物對生活環(huán)境的污染，值得在病理自動化染色中推廣應(yīng)用。

 

參考文獻(xiàn)：

[1] 田玉旺,朱紅艷,李琳,等.GS環(huán)保試劑在病理制片中技術(shù)工作中的應(yīng)用.2011年全國病技術(shù)新進(jìn)展研討會論文匯編,2011:25-28
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